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优化实验室仪器PCR仪温度退火

发布时间:2020-09-25

       实验室仪器当中PCR仪试验是比较简单的分子生物学实验了,但是通常会受到下列各种因素的影响……

提到 PCR仪试验优化,大家的第一反应就是优化退火温度,但你知道变性温度也需要优化吗?


小编告诉你,实在太有必要了!来看看下面的实验:一个证明变性温度也很重要的实验

实验样品:20ng 人基因组 DNA (Roche)

目标基因:β-actin 基因,扩增产物长度 484bp,主要的非特异扩增产物长度 350bp

扩增参数:


       在扩增后的样品加入 GelRed (Biotium) 染料,琼脂糖电泳后用凝胶成像系统采集凝胶图像。我们得到的结果是这样的:

PCR仪试验数据

上方的红框:

当我们把变性温度提高到 98.5 度,退火温度在 58 度时,已经开始出现单一的扩增带,白色模模糊糊的非特异性扩增带就已经消失了。而如果把变性温度设置在 95 度,退火温度需要提升至 70 度,非特异性扩增带才会消失。


下方的红框:

在退火温度相同的情况下(从 60.8-68.5 度),如果使用更低的变性温度(93.4度),可以看到主条亮度要明显高于 95 度变性时的亮度,也就是产量更高。


       实验表明,同时优化退火温度和变性温度,才能准确找到最符合我们需求的反应温度。看到优化变性温度的效果这么好,是不是很想马上撸起袖子干呢?

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